LVTS Đánh giá hiệu quả của huyết tương giàu tiểu cầu với sự sống của vạt da trên thực nghiệm

1.1. Tiểu cầu

1.1.1. Hình thể của tiểu cầu

Là những mảnh tế bào không nhân, hình đĩa, đường kính 2-4 Micromet, có màng bao bọc.

Bên trong tiểu cầu có hệ thống ống siêu vi và một hệ thống ống nhỏ do màng tiểu cầu luồn vào bên trong tạo thành một khung xương duy trì hình thái tiểu cầu và giúp tiểu cầu trao đổi với môi trường bên ngoài.

Trong bào tương của tiểu cầu có:

– Những di tích của mạng nội bào và bộ máy Golgi có khả năng tổng hợp nhiều enzyme và dự trữ một lượng lớn ion Calci.

– Ty thể và hệ thống enzyme tạo ra ATP, ADP, serotonin.

– Hệ thống enzyme tổng hợp Prostaglandin, đó là Thromboxan A2 (một chất gây co mạch) và Prostaglandin H2 (một chất gây kết tụ tiểu cầu).

– Protein co (Thrombosthenin) có vai trò trong sự co cục máu đông.

– Yếu tố ổn định Fibrin.

– Yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu làm tăng sinh và phát triển tế bào nội mô mạch, tế bào cơ trơn thành mạch, các nguyên bào xơ… để sửa chữa thành mạch.

Trên bề mặt của màng tiểu cầu có một lớp glycoprotein. Lớp này ngăn cản tiểu cầu kết dính với nội mạc bình thường nhưng lại cho phép tiểu cầu dính vào các sợi collagen ở lớp dưới nội mạc bộc lộ ra khi thành mạch bị tổn thương. Màng tiểu cầu chứa phospholipid trong đó có yếu tố III đóng vai trò hoạt hóa quá trình đông máu.

Số lượng tiểu cầu bình thường trong máu ngoại vi dao động trong khoảng 150,0 G/L đến 300,0 G/L.Trong đó:

Nam: 263,0 ± 61,0 G/L

Nữ: 274,0 ± 63,0 G/L

Tiểu cầu được tổng hợp ở tủy xương rồi đưa vào hệ tuần hoàn. Thời gian bán hủy của tiểu cầu khoảng 7 ngày. Nếu không bị tiêu thụ trong quá trình đông máu, tiểu cầu sẽ bị các đại thực bào tiêu hóa và phá hủy ở gan và lách [7].

1.1.2. Chức năng của tiểu cầu

Chức năng tạo cục máu đông

Khi tiểu cầu tiếp xúc với bề mặt của mạch máu bị tổn thương, các tiểu cầu thay đổi rất mạnh, chúng phồng to lên, tạo thành hình dạng bất thường với rất nhiều chân giả. Chúng gắn với yếu tố Von Willebrand, giải phóng lượng lớn ADP và TAx2, hoạt hóa thêm các tiểu cầu khác, làm thành một quá trình cấp số nhân rất nhanh, làm hoạt hóa ngưng kết một lượng lớn tiểu cầu.

Hình 1.1. Hình thể tiểu cầu

*Nguồn : Theo Alan Michelson và cộng sự (2013)[8]

Cho nên, ở mỗi vị trí thủng của mạch máu sẽ xuất hiện các nút tiểu cầu. Mặc dù chúng vẫn còn lỏng lẻo, nhưng thường đủ để bịt tạm các tổn thương nhỏ. Sau đó kết hợp với các con đường đông máu nội ngoại sinh tạo thành cục máu đông vững chắc có tác dụng cầm máu.

Hạt Alpha tiểu cầu và các chức năng sinh lý khác của tiểu cầu

Tiểu cầu đảm nhiệm các chức năng khác của nó thông qua các hạt tiết nằm trong bào tương, bao gồm: hạt Alpha, hạt đặc và lysosome [8].

Khi được kích hoạt (ví dụ, bởi thrombin), tiểu cầu thay đổi hình dạng, phát triển giả mạc, thúc đẩy sự kết tập tiểu cầu và giải phóng nội dung hạt thông qua hệ thống ống tủy mở.

Nhiều nghiên cứu cho thấy có hơn 300 protein hòa tan được giải phóng bởi hạt Alpha, bao gồm rất nhiều protein với các chức năng rất phong phú.

Bảng 1.1. Protein được giải phóng từ hạt alpha

LOẠI

VÍ DỤ

Protein gắn màng

P-selectin, TLT- 1

Đông máu, chống đông và tiêu sợi huyết

Yếu tố 5, 9, 13, antithrombin, Plasminogen, TFPI

Protein gắn

Fibrinogen, yếu tố Von Willerbrand, thrombospondin

Chemokines

CXCL 1, 4, 5, 7

Yếu tố tăng trưởng

EGF, HGF, IGF

Yếu tố sinh mạch

VEGF, FGF. PDGF

Các Protein có tác dụng diệt khuẩn

Thrombocidins 1, 2

Yếu tố điều hòa miễn dịch

Tiền yếu tố C3, C4, yếu tố D, H, IgG

*Nguồn : Theo Alan Michelson và cộng sự (2013)[8]

+ Vai trò của hạt Alpha trong đông máu được khẳng định qua một số đặc điểm sau:

Hạt Alpha chứa rất nhiều thành phần tham gia vào các giai đoạn của quá trình đông máu.

Các yếu tố gắn tham gia vào quá trình hoạt hóa tiểu cầu: Yếu tố Von Willebrand: hạt Alpha chiếm 20% tổng lượng của tiểu cầu, receptor cho fibrinogen (integrin, GPIIbIIIa: từ 1/2 đến 2/3 tổng lượng của tiểu cầu), receptor cho collagen (GPVI: chiếm >1/3 tổng lượng của tiểu cầu).

Các yếu tố đông máu: Yếu tố V, XI, XIII, thrombin, prothrombin và các kininogen trọng lượng phân tử cao có tác dụng kích thích dòng thác đông máu nội sinh.

Yếu tố ức chế tiêu sợi huyết như PAI-1 và α2-antiplasma [8].

+ Vai trò của hạt Alpha trong tăng sinh mạch

Hạt alpha chứa rất nhiều yếu tố liên quan đến quá trình tân sinh mạch máu, bao gồm các yếu tố như: yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF), yếu tố tăng trưởng thượng bì (EGF), yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF).

Ngoài ra còn có một số yếu tố khác cũng tham gia vào quá trình tăng sinh mạch như CXCL12 có vai trò huy động các tiền tế bào CD34+ và kích thích quá trình biệt hóa của chúng thành các tiền tế bào nội mô mạch máu, các metalloproteinase-1,2,9…[8].

+ Vai trò của hạt Alpha trong liền vết thương

Các nghiên cứu in vitro đã nhận thấy chất tiết từ tiểu cầu làm tăng quá trình tăng sinh và di trú của các nguyên bào tạo xương, làm kích thích tăng sinh tế bào cơ, tế bào ổ chân răng hay kích thích làm tăng tổng hợp các yếu tố tăng trưởng như VEGF và HGF. Trong các nghiên cứu in vivo nghiên cứu trên chuột bị tiểu đường cũng có vai trò làm tăng nhanh quá trình liền vết thương ở nhóm này [8].

1.2. Huyết tương giàu tiểu cầu (PRP)

1.2.1. Định nghĩa PRP

Là huyết tương tự thân chứa nồng độ tiểu cầu trên ngưỡng bình thường [1].

1.2.2. Các yếu tố tăng trưởng

Sự tăng sinh của rất nhiều tế bào phụ thuộc vào kích thích của các polipeptid với tên gọi chung là các yếu tố tăng trưởng. Các yếu tố này kích thích sự phiên mã của các gen không hoạt động trong các ở trạng thái bình thường, bao gồm các gen điều hòa sự ra vào của chu trình tế bào.

Bảng 1.2. Các yếu tố tăng trưởng

YẾU TỐ

KÍ HIỆU

NƠI SẢN XUẤT

CHỨC NĂNG

Yếu tố tăng trưởng biểu bì

EGF

Tiểu cầu, đại thực bào, nước bọt, …

Kích thích phân chia các tế bào sừng và nguyên bào sợi. Kích thích tế bào sừng di trú và tạo mô hạt

Yếu tố tăng trưởng nội mạch

(kiểu A, B, C, D)

VEGF

Nhiều loại tế bào

Tăng tính thấm thành mạch, tăng sinh mạch, kích thích phân chia tế bào nội mô

Yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu

(kiểu A, B, C, D)

PDGF

Tiểu cầu, đại thực bào, tế bào sừng, tế bào nội mô, tế bào cơ trơn

Hóa ứng động và hoạt hóa bạch cầu đa nhân, đại thực bào, nguyên bào sợi

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi

FGF

Đại thực bào, tiểu cầu, tế bào lympho, nguyên bào sợi, tế bào nội mô

Hóa ứng động và kích thích phân chia nguyên bào sợi

Tăng sinh mạch, co vết thương, tạo sẹo

Yếu tố tăng trưởng biến đổi Alpha

TGF – Alpha

Tiểu cầu, đại thực bào, tế bào sừng, tế bào lympho

Kích thích phân chia hầu hết các tế bào biểu mô

Yếu tố tăng trưởng biến đổi Beta

TGF – Beta

Tiểu cầu, tế bào lympho, đại thực bào, tế bào sừng, nguyên bào sợi

Hóa ứng động đại thực bào, nguyên bào sợi, tế bào lympho, tế bào cơ trơn

Tăng sinh mạch

Yếu tố hoại tử khối u

TNF

Đại thực bào, tiểu cầu, tế bào lympho

Hoạt hóa đại thực bào

Điều hòa các cytokine

*Nguồn : Voja P. và cộng sự (2016) [12]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong tiểu cầu chứa nhiều yếu tố tăng trưởng. Sau khi các tiểu cầu được kích hoạt, các yếu tố tăng trưởng được giải phóng liên tục trong một thời gian nhất định. Huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) chứa nồng độ cao và tỷ lệ thích hợp của các phân tử có hoạt tính sinh học để chữa lành vết thương, chẳng hạn như TGF-β1, TGF-β2, EGF, FGF, PDGF, VEGF và IL-1 [12],[13].

1.2.3. Cách thức điều chế PRP

– Nguyên lý của các phương pháp điều chế PRP

Trọng lượng riêng của các thành phần của tế bào máu là không như nhau trong đó hồng cầu là nặng nhất (1,095) sau đó đến bạch cầu (1,063-1,085), tiểu cầu (1,032) và cuối cùng là huyết tương (1,024-1,028). Vì vậy, khi để máu toàn phần trong ống nghiệm, dưới tác dụng của trọng lực trái đất, các thành phần máu sẽ lắng về phía đáy với các tốc độ khác nhau, trong đó các chất có trọng lượng phân tử cao sẽ lắng nhanh hơn và ngược lại. Nguyên lý của quá trình ly tâm chính là thay thế trọng lực của trái đất bằng lực ly tâm nhằm thúc đẩy quá trình này. Nên với một tốc độ và thời gian ly tâm phù hợp, sau ly tâm ta sẽ thu được một dung dịch có ba lớp, với thành phần trong các lớp có trọng lượng phân tử tăng dần từ trên xuống dưới:

+ Lớp huyết tương giàu tiểu cầu ở trên cùng (2 thành phần nhẹ nhất).

+ Lớp buffy coat là một lớp mỏng màu trắng ở giữa chứa chủ yếu là bạch cầu.

+ Lớp tế bào hồng cầu ở dưới đáy [14]

– Chất chống đông

PRP được sản xuất trực tiếp từ máu toàn phần, vì vậy việc lựa chọn chất chống đông sao cho không ảnh hưởng đến lượng tiểu cầu thu được là rất quan trọng.

Các nghiên cứu đến thời điểm hiện tại đều khuyến cáo việc sử dụng acid citrate dextrose (ACD) cho việc điều chế PRP vì chúng giúp bảo tồn hình thái và chức năng của tiểu cầu, duy trì được lượng tiểu cầu còn chức năng cao sau khi điều chế [15],[16].

– Các phương pháp điều chế PRP

+ Phương pháp ly tâm một lần:

Sau khi ly tâm một lần, thu lớp trên cùng là huyết tương giàu tiểu cầu

+ Phương pháp ly tâm hai lần:

Sau khi ly tâm lần một, thu lấy lớp huyết tương ở trên.

Sau đó đem huyết tương thu được ly tâm lần hai, sản phẩm thu được gồm: lớp huyết tương nghèo tiểu cầu ở 2/3 trên được bỏ đi, phần còn lại là huyết tương giàu tiểu cầu được sử dụng.

Hình 1.2. Quy trình điều chế PRP

*Nguồn: Theo Rachita D. và cộng sự (2016)[14]

– Tốc độ và thời gian ly tâm

Chất lượng và số lượng tiểu cầu thu được phụ thuộc nhiều vào tốc độ và thời gian ly tâm. Qua tham khảo nhiều nghiên cứu về quy trình điều chế PRP [14],[17], lựa chọn:

+ Ly tâm lần 1 (Ly tâm mềm): Tốc độ và thời gian ly tâm tối ưu trong khoảng 200 – 400g trong 8 phút. Tiểu cầu được phân tách tối đa và phân bố đồng đều hơn ở lớp huyết tương phía trên

+ Ly tâm lần 2 (Ly tâm rắn): Tốc độ và thời gian ly tâm tối ưu trong khoảng 400 – 700g trong 5 phút.Thu được nồng độ tiểu cầu cao nhất ở 1/3 lớp huyết tương dưới.

Đổi đơn vị gia tốc RPM sang RCF:

RCF = 1.18*10^-5 * r * RPM^2

Trong đó : RCF : lực ly tâm tương đối (g)

RPM : tốc độ quay (vòng/phút)

r : đường kính từ trung tâm roto đến đáy ống

Hình 1.3. Thước chuyển đổi nhanh

*Nguồn: Theo Rachita D. và cộng sự (2016)[14]

– Kích hoạt PRP

Ở trạng thái bình thường, các hạt Alpha chứa các yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu không được giải phóng. Khi điều chế PRP, một phần nhỏ tiểu cầu được kích hoạt do cơ học, do thrombin tự thân trong máu. Nhưng để thu được nồng độ tối đa các yếu tố tăng trưởng, cần kích hoạt toàn bộ tiểu cầu giải phóng hạt Alpha và phóng thích các yếu tố tăng trưởng.

Có nhiều cách để kích hoạt tiểu cầu trong PRP, chất lượng của PRP cũng ảnh hưởng bởi yếu tố kích hoạt.

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, sử dụng chất kích hoạt là 10% hỗn hợp của Canxiclorua và Thrombin là tối ưu nhất [18]. Khi đó, hỗn hợp này đối kháng với tác dụng chống đông máu của citrat, hoạt hóa tiểu cầu, chuyển fibrinogen thành fibrin.

1.2.4. Ứng dụng lâm sàng của PRP

– Trên thế giới

Ở tình trạng thông thường thì tiểu cầu là nguồn dự trữ tự nhiên của các yếu tố tăng trưởng bao gồm PDGF, EGF, TGF, FGF, VEGF,….Các yếu tố này được giải phóng khỏi tiểu cầu được hoạt hóa và có vai trò quan trọng trong quá trình liền thương do vai trò của chúng trong hóa ứng động, tăng sinh, biệt hóa, thúc đẩy quá trình phân chia và chuyển hóa tại mô tổn thương dẫn đến việc ứng dụng trong lâm sàng các chế phẩm PRP nhằm tăng nồng độ tiểu cầu tại mô bị tổn thương với mục đích tăng cường số lượng các yếu tố tăng trưởng tại chỗ và qua đó thúc đẩy quá trình hồi phục tự nhiên của cơ thể [1]. PRP cũng đã được nghiên cứu rộng rãi về các ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau, và được chứng minh là có hiệu quả trong việc sửa chữa và phục hồi các vết gãy và chữa lành các khuyết tật xương, tổn thương giác mạc[19],[20].

+ Trong thẩm mỹ:

Trong phẫu thuật thẩm mỹ của vùng mặt, hiệu quả của PRP đã được ghi nhận rất nhiều.Qua một nghiên cứu tổng hợp các báo cáo về ứng dụng điều trị của PRP đối với các phẫu thuật vùng mặt cho thấy : 13 nghiên cứu in vitro cho thấy PRP có vai trò rõ rệt trong hoạt động tế bào, 24/28 nghiên cứu trên động vật cho kết quả tốt với việc sử dụng PRP, trong đó 5/6 nghiên cứu cho thấy sự tăng khả năng tồn tạo và phát triển của mảnh ghép, 44/47 nghiên cứu sử dụng PRP cho kết quả tốt đáng kể về phát triển tế bào, hồi phục vết thương cũng như tái tạo thẩm mỹ [21].